用于多囊卵巢综合征检测的外泌体代谢物及其用途的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，具体地涉及用于多囊卵巢综合征检测的外泌体代谢物及其用途。


背景技术：

2.外泌体(exosome)已被确定为诊断和治疗内分泌系统疾病(包括多囊卵巢综合征(以下简称为“pcos”))的有希望的靶点，但源自于外泌体的代谢物在这些疾病中的潜在作用研究较少。
3.多囊卵巢综合征(简称为“pcos”)是一种常见的生化疾病，发病率为5％至10％。它是由于少排卵或无排卵引起的女性不孕的主要原因。pcos的主要临床症状是月经异常(稀少或闭经)、多毛、痤疮、肥胖、不孕等。长期并发症包括高血压、高脂血症和心血管疾病、糖尿病等，严重危害女性身心健康。
4.目前，pcos的发病机制尚不清楚，pcos的发病机制已成为生殖医学研究的热点。外泌体是由胞吐分泌的膜蛋白，直径为30-150nm。它们被认为是多囊体与质膜融合后分泌的。其内容物(如核酸、蛋白质和脂质)参与调节受体的表型。此外，外泌体还参与细胞间通讯、凝血、核酸和蛋白质转移，还具有类似抗原的作用，以刺激体内的免疫反应。例如，血液外泌体mirnas是各种疾病，如乳腺癌、动脉粥样硬化和精神分裂有前途的生物标志物。
5.近年来，外泌体代谢组学作为生物诊断标志物的研究逐渐增加，应用领域包括精神疾病、癌症、肿瘤等。不同组织和器官来源的外泌体各不相同，但大多数研究仅限于一种来源的外泌体。因此，研究同一疾病不同来源外泌体的共同鉴别标志物将具有更广泛的应用和临床指导意义。
6.背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。


技术实现要素：

7.为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明通过对血液和卵泡液外泌体的代谢组学分析，鉴定了共存的特异性标志物，同时本发明采用超高效液相色谱-串联质谱(uplc-ms/ms)研究了pcos患者和健康对照(hc)的外泌体代谢组学特征，并开发了源自外泌体的代谢物，它们在区分pcos患者和健康人群方面具有优异的性能。具体地，本发明包括以下内容。
8.本发明的第一方面，检测来源于外泌体的代谢物的试剂在制备用于诊断多囊卵巢综合征的医疗装置中的用途，其中，所述外泌体的代谢物包括13-oxoode和/或9-oxoode。
9.在某些实施方案中，根据本发明所述的用途，其中，所述医疗装置包括含有所述试剂的试剂盒。
10.在某些实施方案中，根据本发明所述的用途，其中，所述医疗装置进一步包括用于显示检测结果的仪器。
11.在某些实施方案中，根据本发明所述的用途，其中，所述外泌体的代谢物来源于受试者的流体样本，所述流体优选为血清。
12.在某些实施方案中，根据本发明所述的用途，其中，所述试剂包括：外泌体提取试剂和外泌体代谢物分离检测试剂。
13.本发明的第二方面，提供一种多囊卵巢综合征的检测试剂盒，其包括用于检测外泌体的代谢物的试剂，所述外泌体的代谢物包括13-oxoode和/或9-oxoode。
14.在某些实施方案中，根据本发明所述的试剂盒，其中，所述试剂包括外泌体提取试剂和外泌体代谢物分离检测试剂。
15.本发明的第三方面，提供一种用于多囊卵巢综合征诊断的系统，其中，所述系统包含：
16.检测单元：所述检测单元用于检测来源于外泌体的代谢物并确定所述外泌体的代谢物的量，所述外泌体的代谢物包括13-oxoode和/或9-oxoode；
17.结果判断单元：所述结果判断单元用于根据所述检测单元检测得到的所述外泌体的代谢物的量的结果，判断受试者患有多囊卵巢综合征的风险；
18.显示单元，所述显示单元用于输出并显示受试者患有多囊卵巢综合征的风险。
19.在某些实施方案中，根据本发明所述的系统，其中，所述检测单元包括第二方面所述的试剂盒。
20.在某些实施方案中，根据本发明所述的系统，其中，进一步包括与所述试剂盒联用的色谱和/或质谱仪。
21.在某些实施方案中，根据本发明所述的系统，其中，所述结果判断单元含有输入单元和分析单元，所述输入单元用于输入外泌体的代谢物的量；所述分析单元用于根据所述外泌体的代谢物的量，分析出受试者是否患有多囊卵巢综合征或患有多囊卵巢综合征的风险。
22.本发明通过超高效液相色谱-串联质谱对pcos患者样本(例如血清、卵泡液)来源的外泌体进行了代谢组学研究，分别在血清外泌体和卵泡液外泌体中鉴定了可用于区分患者和对照样本的105种不同的代谢物。为了提高准确性，通过分析血清和卵泡液外泌体差异代谢物，本发明进一步鉴定了30种差异代谢物，生物信息学分析表明，这些代谢物通过与pcos相关的脂质代谢途径，如不饱和脂肪酸代谢而富集。总之，本发明的发现支持外泌体衍生代谢物在pcos病理生理学中的作用，并表明外泌体衍生代谢物能够有效用于pcos的诊断。
附图说明
23.图1示出了多囊卵巢综合征血液外泌体代谢物差异表达的生物信息学筛选结果，其中(a)主要成分分析(pca)和(b)正交偏最小二乘方判别分析(opls-da)模型图，该模型图基于在来自pcos患者(hpx)和健康对照(hjx)的血清外泌体代谢物中检测到的代谢物。(c)显示hpx和hjx患者之间代谢物差异火山图。(d)与10名健康对照相比，10名pcos患者中20种差异表达的血液外泌体代谢物的图示。(e)20种差异表达代谢物的kegg富集途径。
24.图2示出了多囊卵巢综合征卵泡液外泌体代谢物差异表达的生物信息学筛选结果，其中(a)主要成分分析(pca)和(b)基于在pcos(pl)和hc(jl)患者的卵泡液外泌体代谢
物中检测到的代谢物的正交偏最小二乘方判别(opls-da)模型图。(c)显示pl和jl患者之间代谢物差异火山图。(d)与10名健康对照相比，10名pcos患者中20种差异表达的卵泡液外泌体代谢物的图示。(e)20种差异表达代谢物的kegg富集途径。
25.图3示出了多囊卵巢综合征外泌体生物标志物的筛选结果，其中(a)pcos患者和健康个体的血液和卵泡液外泌体的差异代谢物中存在30种相同的差异代谢物。(b)相同的30种差异表达的代谢物在四种kegg途径中富集。(c、e、g、i)通过质谱法检测pcos患者和健康对照者血液外泌体和卵泡液外泌体中代谢物的表达水平(vip》2，p《0.05)。d、f、h、j的受试者工作特征(roc)曲线显示代谢物在区分pcos患者和hc中的准确性。
具体实施方式
26.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
27.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
28.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
29.外泌体的代谢物
30.本发明的一个方面，提供一种用于检测内分泌系统疾病的外泌体的代谢物(本文有时也称为分子标志物)，其中，所述外泌体的代谢物包括13-oxoode和/或9-oxoode。本发明的分子标志物为外泌体的代谢物，优选为外泌体的小分子脂质代谢物。
31.在一个优选的实施方案中，内分泌系统疾病为多囊卵巢综合征。
32.在一个优选的实施方案中，代谢物13-oxoode为13-氧代-9z,11e-十八碳二烯酸。
33.在一个优选的实施方案中，代谢物9-oxoode为9-氧代-10e,12z-十八碳二烯酸。
34.除非另有说明，本文所用术语“检测”是指包括确定样品中的外泌体代谢物存在与否和/或定量的方法。需要说明的是，本文所述的“量”应做以下广义理解：既可指定量结果，也可指半定量结果，既可指绝对含量，也可指相对含量。另外，本文涉及“确定、判断、鉴定、诊断受试者患有多囊卵巢综合征(pcos)的风险”既可以包括已经患有多囊卵巢综合征，也包括有可能已经患有多囊卵巢综合征的情况。
35.用途
36.本发明的另一个方面，提供检测来源于外泌体的代谢物的试剂在制备用于诊断多囊卵巢综合征的医疗装置中的用途，本文所用术语“医疗装置”包括用于检测外泌体代谢物的试剂盒和/或色谱和/或质谱仪器。
37.本发明中，外泌体的代谢物来源于生物样品，生物样品类型的实例包括但不限于
以下的一种或多种：全血、血清、血浆、血液成分、卵泡液、唾液、尿液、乳汁(包括初乳、母乳)、腹水、羊水、眼泪、骨髓、细胞、组织、器官、体液、淋巴液、脑脊髓液、病变渗出物和由身体产生的其他流体。在一个优选的实施方案中，本文所述生物样品为血清。在另一个优选的实施方案中，本文所述生物样品为卵泡液。
38.本文所用术语“受试者”和“患者”可互换使用，包括脊椎动物，优选为哺乳动物，还优选为人。哺乳动物包括但不限于鼠类、猿、家畜等，具体的哺乳动物包括大鼠、小鼠、猫、狗、猴子和人。非人类哺乳动物包括除人之外的所有哺乳动物。
39.本发明通过研究发现，健康人群和pcos患者的样本外泌体在某些小分子脂质代谢物存在表达差异，因此可以作为pcos的诊断标志物。“表达差异”包括本文所述的小分子脂质代谢物的量(或表达)异常升高或者降低的情况。在某些实施方案中，患者中的外泌体小分子脂质代谢物13-oxoode的量(或表达)相较于未患病受试者中的外泌体小分子脂质代谢物13-oxoode的量(或表达)显著升高。在某些实施方案中，患者中的外泌体小分子脂质代谢物9-oxoode的量(或表达)相较于未患病受试者中的外泌体小分子脂质代谢物9-oxoode的量(或表达)显著升高。
40.在一个优选的实施方案中，本发明采用色谱和/或质谱技术通过脂质组学研究并筛选得到本发明的分子标志物，特别是通过超高效液相色谱-串联质谱uplc-ms/ms技术进行外泌体的代谢物的鉴定以及定量。uplc和ms/ms可以使用本领域已知的色谱或质谱仪，对此不特别限定。在具体实施方案中，采用uplc，shim-pack uflc shimadzu cbm30a和ms，applied biosystems 4500qtrap进行代谢谱分析。
41.本发明中，医疗装置包括试剂盒和色谱质谱仪，其中所使用的高效液相色谱柱为waters acquity uplc hsst3 c18(1.8μm,2.1mm*100mm)。溶剂体系包括：水(0.04％乙酸)：乙腈(0.04％乙酸)。进行梯度程序如下：在0分钟时为100：0(v/v)，在第10.0分钟时为5：95(v/v)，在第11.0分钟时为5：95(v/v)，在第11.1分钟时为95:5(v/v)，在第15.0分钟时为95:5(v/v)。流速为0.15-0.90ml/min，优选为0.25-0.45ml/min，还优选为0.31-0.39ml/min。温度为35-55℃，优选为38-45℃，还优选为38-42℃。进样体积为1-8μl，优选为3-6μl。流出液交替连接到esi-三重四极线性离子阱(q trap)-ms。
42.在某些实施方案中，使用api 4500q trap lc/ms/ms系统，在三重四极线性离子阱质谱仪(q trap)上进行lit和三重四极(qqq)扫描，该系统设置有esi turbo离子喷雾接口，在正离子和负离子模式下运行，由analyst 1.6.2软件(ab sciex)控制。优选地，esi源运行参数如下：离子源、涡轮喷雾；源温度400-650℃，优选为450-600℃，进一步优选为500-550℃。离子喷雾电压(is)为4000-6000v，优选为4500-5500v，还优选为5000-5500v。离子源气体i(gsi)、气体ii(gsii)和帘气(cur)分别设置为55、60和25.0psi。碰撞气体(cad)设置为高。qqq扫描是通过多重反应监测(mrm)实验获得，碰撞气体(氮气)设置为5psi。对各个mrm转换的dp和ce进行进一步的dp和ce优化。根据在此期间洗脱的代谢物，对每个时期的特定mrm转变进行监测。
43.本发明的小分子代谢物定性和定量原则可以参考代谢物信息公共数据库，对质谱检测的一阶和二阶光谱进行定性分析。对其中部分物质进行定性分析，去除同位素信号，去除含有钾离子、钠离子、铵根离子的重复信号，去除比本发明代谢物本身的分子量更大碎片离子的重复信号。
44.本发明的小分子代谢物结构解析和确认也可以参考例如massbank、knapsack、hmdb或者现有的质谱公共数据库如moto db和metlin，对此不特别限定。
45.在本发明中，可以使用多重反应监测(mrm)三重四极杆质谱进行本文所述的小分子代谢物的定量。例如，在mrm模式下，四极杆首先筛选目标物质的母离子，排除其他分子量物质对应的离子，初步消除干扰，母离子在碰撞池中诱导电离形成多个片段离子，然后通过三重四极子滤波器从特征片段离子中筛选出所需的一个，排除非目标离子干扰，使定量更准确，重复性更好。在获得不同样品的质谱分析数据后，对所有质谱峰的峰面积进行积分，并对不同样品中相同代谢物的质谱峰进行积分校正。
46.在一个优选的实施方案中，为了筛选具有诊断价值和诊断意义的差异小分子代谢标志物，设置vip》1.5且p值《0.05的阈值组合来进行差异生物标志物的筛选。在一个更优选的实施方案中，设置vip》2且p值《0.05的阈值组合来进行显著差异物的生物标志物的筛选。p值来源于单维统计分析(如t-test)，vip值来源于多元变量统计分析(如opls-da)以表征该变量对两组差异的贡献值。可以理解的是，阈值不限于上述vip值和p值，还可以包括logfc值，其中fc是指fold change。
47.本领域技术人员在本发明的教导下，也可以使用其它方式进行差异小分子代谢物的筛选，例如，以p值《0.05，对vip值做排序，vip值越大，差异代谢物更具有诊断意义。在另外的实施方案中，对vip》1(如1.5、2)，对p值做排序，p值越小，差异代谢物更具有诊断意义。
48.本发明中，用于检测外泌体代谢物的试剂适于的检测手段不受特别限制，只要能够定量或半定量标志物的表达量或相对表达量即可。优选地，检测标志物的试剂包括外泌体提取试剂、外泌体处理试剂、外泌体代谢物分离检测试剂，所述试剂适用于高效液相色谱、超高效液相色谱、飞行时间质谱法等检测所述标志物。
49.本发明中，外泌体提取试剂包括购自izon的qev柱和预先配制的缓冲液pbs、0.1％triton x-100和0.5m naoh等。也可以使用本领域其他已知的分离试剂盒，例如购自invitrogen的total exosome isolation试剂盒。
50.本发明中，外泌体处理试剂包括甲醇。
51.本发明中，外泌体代谢物分离检测试剂包括用于uplc和lc-ms/ms的试剂，其包括水(0.04％乙酸)、乙腈(0.04％乙酸)等。
52.试剂盒
53.本发明进一步提供试剂盒，所述试剂盒包含检测外泌体的代谢物的试剂，所述外泌体的代谢物包括13-oxoode和/或9-oxoode。
54.本发明的试剂盒包括外泌体提取试剂、外泌体处理试剂、外泌体代谢物分离检测试剂，其中，外泌体提取试剂包括购自izon的qev柱和预先配制的缓冲液pbs、0.1％triton x-100和0.5m naoh等。也可以使用本领域其他已知的分离试剂盒，例如购自invitrogen的total exosome isolation试剂盒。外泌体处理试剂包括甲醇。外泌体代谢物分离检测试剂包括用于uplc和lc-ms/ms的试剂，其包括水(0.04％乙酸)、乙腈(0.04％乙酸)等。
55.除了上述组分之外，本发明的试剂盒还可包括以政府机构规定的形式与调控制造、使用或销售诊断试剂盒相关的注意事项。另外，本发明的试剂盒还可提供有使用、储存和故障排除的详细说明书。试剂盒还可任选地设置在适合的优选用于以高通量设置的机器人操作的装置中。
56.在某些实施方案中，本发明的试剂盒的组分可提供为干粉。当试剂和/或组分提供为干粉时，粉末可通过添加适合的溶剂来恢复原状。预期该溶剂还可设置于另一容器中。容器通常会包括至少一种小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器和/或其它容器手段，其中可选等分地放置溶剂。试剂盒还可包括用于包含无菌、药学上可接受的缓冲液和/或其它溶剂的第二容器的手段。
57.在某些实施方案中，本发明的试剂盒的组分可以溶液形式提供，例如水溶液的形式提供。在以水溶液状态存在的情况下，这些成分的浓度或含量是本领域技术人员能够根据不同需求而方便地确定的。例如，用于储存的目的时，例如试剂的浓度可以较高的形式存在，当处于工作状态或使用时，可通过例如稀释上述较高浓度的溶液来将浓度降低至工作浓度。
58.在试剂盒中存在超过一种组分的情况下，该试剂盒还通常会包含可单独放置另外的组分的第二、第三或其它另外的容器。另外，可在容器中包含各多种组分的组合。本文所述的任何组合或试剂可为试剂盒中的组分。
59.可以理解，本发明检测外泌体的代谢物的试剂进一步包括能够特异性识别外泌体的代谢物的试剂，所述试剂适用于高效液相色谱、超高效液相色谱、飞行时间质谱法等，从而有效探测到标志物的量或表达量或相对表达量。
60.用于pcos诊断的系统
61.本发明的另一方面，提供一种用于pcos诊断的系统，所述系统包含：
62.检测单元：所述检测单元用于检测来源于外泌体的代谢物并确定所述外泌体的代谢物的量，所述外泌体的代谢物包括13-oxoode和/或9-oxoode；
63.结果判断单元：所述结果判断单元用于根据所述检测单元检测得到的所述外泌体的代谢物的量的结果，判断受试者患有多囊卵巢综合征的风险；
64.显示单元，所述显示单元用于输出并显示受试者患有多囊卵巢综合征的风险。
65.在一个优选的实施方案中，所述结果判断单元含有输入单元和分析单元，所述输入单元用于输入所述外泌体的代谢物的量；所述分析单元用于根据所述外泌体的代谢物的量，分析出受试者是否患有pcos或患有pcos的风险。
66.在某些实施方案中，所述分析单元用于根据所述生物标志物的量与标准值进行比较，当受试者中的外泌体小分子脂质代谢物13-oxoode的量(或表达)相较于标准值显著升高，则将所述受试者判断为患有pcos或患有pcos的风险高；和/或所述分析单元用于根据所述生物标志物的量与标准值进行比较，当受试者中的外泌体小分子脂质代谢物9-oxoode的量(或表达)相较于标准值显著升高，则将所述受试者判断为患有pcos或患有pcos的风险高。
67.本发明中，标准值是指未患有pcos的健康人群的13-oxoode和/或9-oxoode的量。
68.在一个优选的实施方案中，检测单元包括本文所述的试剂盒以及用于检测所述外泌体的代谢物的色谱和/或质谱仪。
69.本领域的技术人员可以理解的是，本发明所述的各种示例性实施方案可以通过软件实现，也可以通过软件结合必要的硬件的方式来实现。因此，根据本发明的具体实施方案可以以软件产品的形式体现出来，该软件产品可以存储在一个非易失性存储介质或非暂态计算机可读存储介质(可以是cd-rom、u盘、移动硬盘等)中或网络上，包括若干指令以使得
计算设备(可以是个人计算机、服务器、移动终端、或者网络设备等)执行根据本发明的方法。
70.在示例性实施方案中，本发明的程序产品可以采用一个或多个可读介质的任意组合。可读介质可以是可读信号介质或者可读存储介质。可读存储介质例如可以为但不限于电、磁、光、电磁、红外线或半导体的系统、装置或器件，或者任意以上的组合。可读存储介质的更具体的实例包括但不限于：具有一个或多个导线的电连接、便携式盘、硬盘、随机存取存储器(ram)、只读存储器(rom)、可擦式可编程只读存储器(eprom或闪存)、光纤、便携式紧凑盘只读存储器(cd-rom)、光存储器件、磁存储器件、或者上述的任意合适的组合。
71.相应地，基于同一发明构思，本发明还提供一种电子设备。
72.在示例性实施方案中，电子设备以通用计算设备的形式表现。电子设备的组件可以包括但不限于：至少一个处理器、至少一个存储器、连接不同系统组件(包括存储器和处理器)的总线。
73.其中，所述存储器存储有程序代码，所述程序代码可以被所述处理单元执行，使得所述处理单元执行本发明所述的检测方法，其中处理器至少包括本发明的结果判断单元(也可以称为“单元”)。存储器可以包括易失性存储单元形式的可读介质，例如随机存取存储单元(ram)和/或高速缓存存储单元，还可以进一步包括只读存储单元(rom)。
74.本发明的存储器还可以包括具有一组(至少一个)程序模块的程序/实用工具，这样的程序模块包括但不限于：操作系统、一个或者多个应用程序、其它程序模块以及程序数据，这些示例中的每一个或某种组合中可能包括网络环境的实现。
75.总线可以为表示几类总线结构中的一种或多种，包括存储器总线或者存储器控制器、外围总线、图形加速端口、处理单元或者使用多种总线结构中的任意总线结构的局域总线。
76.电子设备也可以与一个或多个外部设备(例如键盘、显示器、指向设备、蓝牙设备等)通信，还可与一个或者多个使得用户能与该电子设备交互的设备通信，和/或与使得该电子设备能与一个或多个其它计算设备进行通信的任何设备(例如路由器、调制解调器等等)通信。
77.这种通信可以通过输入/输出(i/o)接口进行。并且，电子设备还可以通过网络适配器与一个或者多个网络(例如局域网(lan)，广域网(wan)和/或公共网络，例如因特网)通信。网络适配器通过总线与电子设备的其它模块通信。应当明白，尽管本文未示出，可以结合电子设备使用其它硬件和/或软件模块，包括但不限于：微代码、设备驱动器、冗余处理单元、外部磁盘驱动阵列、raid系统、磁带驱动器以及数据备份存储系统等。
78.实施例
79.本实施例以血液和卵泡液外泌体的代谢组学分析鉴定了特异性标志物，具体如下。
80.一、材料和方法
81.1、材料
82.受试者包括57名pcos患者和54名健康对照hc，上述受试者均招募自湖南省妇幼保健院。pcos根据鹿特丹标准进行诊断。从每组中选择10名招募者，年龄20-35岁，入选标准：未经化疗治疗，无腮腺炎、甲状腺相关疾病和其他妇科相关疾病，无卵巢手术，妊娠g0p0。然
后进行血液和卵泡液分析。所有参与者的数据都是在患者知情同意的情况下获得的，并且该研究得到了湖南省妇幼保健医院伦理委员会机构审查委员会的批准。
83.2、外泌体的分离与验证
84.本发明同时采集了患者和hc的血液和卵泡液样本。让血液样品在室温下凝结2小时，并通过3000g离心15分钟获得血清。收集非溶血性卵泡液样品，以2000rpm离心20分钟，丢弃沉淀物并收集上清液。收集患者和对照的血清和卵泡液样品，并根据制造商的方案(izon)在qev柱上分离血清外泌体。然后，使用基于具有30-kda分子量截止值的聚醚砜膜的蛋白质浓缩器(vivaspin)将外泌体在5000g下浓缩60分钟。通过纳米粒子追踪分析检测外泌体。
85.3、代谢物测定
86.本发明采用uplc(shim-pack uflc shimadzu cbm30asystem)和串联质谱仪(ms/ms)(4500qtrap；applied biosystems)对患者和hc的外泌体进行广泛的靶向代谢组学研究。使用代谢物信息和代谢组学数据管理环境公共数据库(metware)对一级和二级质谱进行定性分析。代谢物定量通过三重四极质谱和多反应监测分析完成。
87.分析条件：高效液相色谱柱，waters acquity uplc hsst3 c18(1.8μm,2.1mm*100mm)；溶剂体系，水(0.04％乙酸):乙腈(0.04％乙酸)；梯度洗脱程序，0分钟时为100：0(v/v)，10.0分钟时为5：95(v/v)，11.0分钟时为5：95(v/v)，在11.1min时为95:5(v/v)，在15.0分钟为95:5(v/v)；流速，0.35ml/min；温度为40℃；进样量：5μl。流出液交替连接到esi-三重四极线性离子阱(qtrap)-ms。
88.使用api 4500q trap lc/ms/ms系统，在三重四极线性离子阱质谱仪(qtrap)上进行lit和三重四极(qqq)扫描，该系统配备esi turbo离子喷雾接口，在正离子和负离子模式下运行，由analyst 1.6.2软件(ab sciex)控制。esi源运行参数如下：离子源、涡轮喷雾；源温度550℃；离子喷涂电压(is)5500v；离子源气体i(gsi)、气体ii(gsii)和帘气(cur)分别设置为55、60和25.0psi；碰撞气体(cad)设置为高。qqq扫描是通过mrm实验获得的，碰撞气体(氮气)设置为5psi。对各个mrm转换的dp和ce进行了进一步的dp和ce优化。根据在此期间洗脱的代谢物，对每个时期的特定mrm转变进行监测。
89.定性分析中去除同位素信号，去除含有钾离子、钠离子、铵根离子的重复信号，去除比代谢物本身的分子量更大碎片离子的重复信号。代谢物结构分辨率参考massbank、knapsack、hmdb以及现有的质谱公共数据库如moto db和metlin。使用多重反应监测(mrm)三重四极杆质谱完成了代谢物的定量。
90.在mrm模式下，四极杆首先筛选目标物质的母离子，排除其他分子量物质对应的离子，初步消除干扰，母离子在碰撞池中诱导电离形成多个片段离子，然后通过三重四极子滤波器从特征片段离子中筛选出所需的一个，排除非目标离子干扰，使定量更准确，重复性更好。在获得不同样品的质谱分析数据后，对所有质谱峰的峰面积进行积分，并对不同样品中相同代谢物的质谱峰进行积分校正。
91.4.生物信息学分析
92.为了了解不同代谢物的生物学功能，采用kegg对它们进行注释。然后，使用metaboanalyst软件将它们映射到kegg途径数据库。p《0.05被认为是显著的富集途径。
93.5、统计分析
94.主成分分析(pca)使用r软件的统计函数prcomp进行。根据检测到的代谢物和投射可变重要性(vip)，从该模型中提取正交偏最小二乘方判别分析(opls-da)模型。通过mann-whitney u检验，差异表达的代谢物被定义为p《0.05和vip》1.5。使用spss 22.0统计分析软件绘制受试者工作特征(roc)曲线，以评估外泌体代谢物在区分pcos患者和hc中的潜力。
95.二、结果
96.1、血清外泌体代谢物在pcos的显著表达
97.应用uplc-ms/ms分析pcos患者和hc患者血清外泌体的差异。广泛靶向的uplc-ms/ms分析检测到数百种代谢物，包括维生素、脂质氧化产物、氨基酸、辅酶、有机酸等。pca评分图显示了患者和对照组之间的代谢物谱(图1a)，表明血液外泌体代谢物浓度中存在pcos信号。为了确定外泌体代谢物在pcos患者和健康对照中的差异表达，建立了opls-da模型(图1b)，其中确定了105个代谢物指标：vip评分》1.5，p《0.05。其中，82个上调，23个下调(图1c和d)。在与不饱和脂肪酸(usfa)代谢和α-亚麻酸(ala)、亚油酸(la)和促性腺激素释放激素的生物合成相关的途径中，发现一个显著的kegg途径富含不同表达的代谢物(图1e)。
98.2、多囊卵巢综合征患者卵泡液外泌体代谢产物的表达
99.同样，本发明分析了pcos患者和uplc-ms/ms hc患者卵泡液外泌体的差异，pca评分图显示了患者和对照组之间的代谢物谱(图2a)。在opls-da模型中(图2b，确定了105个代谢物指标：vip评分》1.5和p《0.05。其中，83个上调，22个下调(图2c和d)。发现代谢物富集的途径与usfa)代谢、la、神经活性配体-受体相互作用和由脂质分解代谢调节的生物合成有关(图2e)。
100.3、外泌体代谢物作为多囊卵巢综合征的生物标志物
101.为了使差异代谢物更具代表性，本发明比较了血液和卵泡液外泌体的差异代谢物，发现了总共30种常见的差异代谢物(图3a)。随后对这些差异代谢物进行了kegg途径富集分析(图3b)，发现差异代谢物在usfa、精氨酸合成、甘油磷脂和花生四烯酸代谢相关途径中富集。最后，设定在vip》2，p《0.05的共同差异代谢物条件下的筛选阈值，共有四种物质符合标准，即11-keto-txb2、13-oxoode、9-oxoode、ffa(18:4)(图3c、e、j、i以及表1)。结果表明，pcos患者和hc患者血液和卵泡液外泌体中该物质代谢物的质谱峰值存在显著差异。同时，进行roc诊断分析并绘制roc曲线(图3d、f、h、j)。这四种物质的曲线下面积(auc)为1(95％ci，1.00-1.00)。它们在pcos患者和hc之间具有显著区别，表明这些外泌体代谢物是pcos的潜在生物标志物。
102.表1
103.compounds物质vipp-valuefold_changelog2fctype11-keto-txb211-酮基-血栓素b22.3860222.1e-070.00141-9.47023down13-oxoode13-氧代-9z,11e-十八碳二烯酸2.3464110.00327707.81679.467232up9-oxoode9-氧代-10e,12z-十八碳二烯酸2.3464110.00327707.81679.467232upffa(18:4)9,12-十八碳四烯酸2.3715160.0001811341.1510.38926up
104.三、讨论
105.多囊卵巢综合征是一种病因多、症状多样的神经内分泌代谢性疾病。代谢产物的分析可用于研究pcos的发生和发展。本发明的代谢组学数据显示，与hc受试者相比，pcos患者的血液和卵泡液外泌体中分别具有105种差异表达的代谢物。这两种外泌体共有30种不同的代谢产物，富含4种代谢途径。最后，生物信息学分析确定了四种外泌体代谢物，它们在
pcos患者和hc之间具有极好的区分性，并可以作为pcos的潜在生物标志物。
106.pcos的诊断通常基于高雄激素血症、排卵功能障碍和多囊卵巢，其他可能导致高雄激素血症和排卵异常的疾病也必须排除。传统的诊断方法有一定的局限性。例如，血清雄激素水平随年龄而变化，排卵障碍难以客观确定，临床高雄激素表现的量化因种族而异。代谢组学研究各种代谢物，它们是体内内源性物质反应的下游产物，反映了细胞代谢过程。目前，代谢组学被认为是诊断和预防各种疾病的有效方法。外泌体作为含有dna、rna、蛋白质、脂质和小分子代谢产物的分泌小泡，具有维持细胞内环境稳态和细胞间通讯的功能。作为脂质双层结构，外泌体可以有效地保护内容物，并具有较高的稳定性。因为它携带关于母细胞的信息，所以它比传统的分子标记物更特异，更适合内分泌疾病的诊断。此外，外泌体广泛存在于体液中，且含量丰富，更容易发现新的生物标志物。
107.分子标记物的变化可用于疾病的早期诊断和病程监测。单源外泌体不能同时反映整体和局部病理状态。本发明的研究集中于卵泡液外泌体和循环血清外泌体进行分析，数据结果反映了局部和整体代谢物的一致差异变化，对已鉴定的生物标志物更加精确。一些研究表明，pcos患者血脂异常的患病率很高，pcos肥胖患者会增加血脂异常的风险。先前的代谢组学研究表明，pcos可能参与脂质氧化、脂肪酸代谢、甘油磷脂代谢、鞘磷脂代谢、甘油代谢、鞘磷脂代谢、类固醇激素代谢等。然而，由于pcos患者血脂代谢物的多样性和复杂性，以及pcos患者不同的入选标准和检测样本，血脂谱的变化尚不清楚，需要进一步研究。本发明的生物信息学分析发现，血液和卵泡液中外泌体共有的不同代谢物的前四种富集途径是usfa代谢、精氨酸合成、甘油磷脂代谢和花生四烯酸代谢，这表明脂质代谢功能障碍在pcos的发生和/或发展中起作用。
108.总之，本发明提供了pcos患者血液和卵泡液中外泌体代谢物紊乱的证据，并在不同来源的外泌体中鉴定了相同的差异代谢物。最后，鉴定了四种潜在的生物标志物来区分pcos，这为pcos的代谢物诊断和病理生理学研究提供了更准确的参考。
109.尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

技术特征：
1.检测来源于外泌体的代谢物的试剂在制备用于诊断多囊卵巢综合征的医疗装置中的用途，其特征在于，所述外泌体的代谢物包括13-oxoode和/或9-oxoode。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述医疗装置包括含有所述试剂的试剂盒。3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述医疗装置进一步包括用于显示检测结果的仪器。4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述外泌体的代谢物来源于受试者的流体样本。5.根据权利要求1-4任一项所述的用途，其特征在于，所述试剂包括：外泌体提取试剂和外泌体代谢物分离检测试剂。6.一种多囊卵巢综合征的检测试剂盒，其特征在于，包括用于检测来源于外泌体的代谢物的试剂，所述外泌体的代谢物包括13-oxoode和/或9-oxoode。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括外泌体提取试剂和外泌体代谢物分离检测试剂。8.一种用于多囊卵巢综合征的诊断系统，其特征在于，所述系统包含：检测单元：所述检测单元用于检测来源于外泌体的代谢物并确定所述外泌体的代谢物的量，所述外泌体的代谢物包括13-oxoode和/或9-oxoode；结果判断单元：所述结果判断单元用于根据所述检测单元检测得到的所述外泌体的代谢物的量的结果，判断受试者患有多囊卵巢综合征的风险；显示单元，所述显示单元用于输出并显示受试者患有多囊卵巢综合征的风险。9.根据权利要求8所述的系统，其特征在于，所述检测单元包括权利要求6或7所述的试剂盒。10.根据权利要求9所述的系统，其特征在于，进一步包括用于检测所述外泌体的代谢物的色谱和/或质谱仪。

技术总结
本发明公开用于多囊卵巢综合征检测的外泌体代谢物及其用途，其中外泌体代谢物包括13-oxoODE和/或9-oxoODE。本发明采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)研究了PCOS患者和健康对照的外泌体代谢组学特征，并发现一组能够有效区分PCOS患者和健康人群的外泌体的代谢物。代谢物。代谢物。


技术研发人员：罗曼 程勇 陈圜圜 柳朝华
受保护的技术使用者：湖南省妇幼保健院
技术研发日：2023.04.28
技术公布日：2023/8/14