一种阅读障碍和耳聋疾病小鼠的构建方法及应用

1.本发明涉及生命科学耳鼻喉科学研究领域，具体涉及一种阅读障碍和耳聋疾病小鼠的构建方法及应用。


背景技术：

2.dyx1c1基因缺失同时会引发阅读障碍和原发性纤毛运动障碍这两种疾病。而目前已经有科学家成功构建出了dyx1c1敲除小鼠，但是该小鼠在出生后只能活到21天，然而小鼠在第14天左右才获得正常听力。因此，对于疾病研究而言需要一种稳定的、存活时间更长的dyx1c1敲除动物模型，以便于观察与研究小鼠的各项疾病特征。


技术实现要素：

3.针对现有技术的不足，本发明提出了一种阅读障碍和耳聋疾病小鼠的构建方法及应用。
4.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
5.一种阅读障碍和耳聋疾病小鼠的构建方法，包括以下步骤：
6.dyx1c1外显子2区域删除一段序列，从而使dyx1c1失活，经繁殖培养后获得dyx1c1敲除小鼠。
7.可选地，还包括以下步骤：
8.观测构建的dyx1c1敲除小鼠是否与患有阅读障碍和原发性纤毛运动障碍小鼠中观察到的相似缺陷；
9.使用短声听性脑干反应和短纯音abr技术评估dyx1c1敲除小鼠的听觉功能，
10.观察小鼠耳蜗的毛束结构。
11.可选地，获得dyx1c1敲除小鼠的具体步骤包括：dyx1c1外显子2区域删除一段序列后获得dyx1c1+/-杂合小鼠f0，随后杂合小鼠f0与fvb野生型小鼠交配获得杂合小鼠f1，杂合小鼠f1之间再次交配即可以获得杂合小鼠f2，其中就包含有dyx1c1敲除小鼠。
12.可选地，观察小鼠耳蜗的毛束结构之前，分别用抗肌球蛋白、抗乙酰化微管蛋白、鬼笔环肽抗体对小鼠耳蜗基底膜的毛细胞、动纤毛和纤毛束进行免疫荧光染色。
13.可选地，通过crispr-cas9技术删除dyx1c1外显子2区域部分序列。
14.可选地，通过耳蜗细胞与抗体染色后观察或者筛查出dyx1c1敲除小鼠。
15.所述的dyx1c1外显子2区域删除一段序列为tgatgggaagagcaaagccaagattggaaatgacacgattcttttcacatt gtataaaaaggagccagttctgtgggatagcctttct。
16.本发明的另一方面，涉及上述的小鼠模型构建方法在研究阅读障碍或原发性纤毛运动障碍中的应用。
附图说明
17.下面结合附图对本发明作进一步的说明。
18.图1为本技术的dyx1c1敲除小鼠构建及繁育方法示意图；
19.图2为本技术的dyx1c1-/-小鼠患有严重的听力损失；图中，(a)：利用crispr-cas9技术删除dyx1c1基因第2外显子区域的特定序列，构建dyx1c1-/-小鼠。(b)：dyx1c1-/-小鼠充满牛奶的胃向右倒转。黄色区域代表胃的位置。st代表胃；r代表右侧；l代表左侧。(c)：qpcr结果显示dyx1c1 mrna在dyx1c1-/-小鼠耳蜗中显著降低。(d)：显示wt、dyx1c1-/-和dyx1c1+/-小鼠基因分型结果的pcr。(e)：western blotting结果显示，在wt小鼠耳蜗中检测到dyx1c1蛋白的存在，而在dyx1c1-/-小鼠中没有。(f)：小鼠耳蜗与抗myosin7a(红色)、抗dyx1c1(绿色)和dapi(蓝色)抗体共染色。dyx1c1荧光信号在wt小鼠corti器官中分布，而在dyx1c1-/-小鼠中几乎没有荧光信号。比例尺为20μm。，(g-i)：出生后(postnatal days，p)p18、p30和p60 dyx1c1-/-小鼠在声音频率4khz和32khz之间的短纯音和短纯音abr阈值高于wt小鼠。(j)wt和dyx1c1-/-小鼠在p60时，在声音频率16khz下的abr波形。红线表示小鼠在该频率下可感知的最小听阈。(k-l)：统计分析显示，dyx1c1-/-小鼠的峰1的潜伏期和幅值均比wt小鼠高2～3倍。数据以均数
±
标准差，***p《0.001，使用双侧非配对t检验。
20.图3为本技术的dyx1c1敲除小鼠所表现的纤毛疾病特征，其中，(a)为p18时期wt和dyx1c1-/-小鼠耳蜗中纤毛束的代表性扫描电镜图像；黄色箭头为动纤毛(kinocilium)，比例尺＝5μm。(b)为(a)中动纤毛数量的统计分析；数据以均数
±
s.d.。***p《0.001，使用双尾、未配对的student的t检验。(c)p4时期wt和dyx1c1-/-小鼠耳蜗中圈纤毛束及动纤毛的代表性扫描电镜图像，dyx1c1-/-小鼠耳蜗的动纤毛的尖端呈球形。比例尺为2μm。(d)分别用抗肌球蛋白myosin7a(蓝色)、抗乙酰化微管蛋白anti-acetylated tubulin(绿色)、鬼笔环肽phalloidin(红色)抗体对p4小鼠耳蜗基底膜的毛细胞、动纤毛和纤毛束进行免疫荧光染色。比例尺为10μm。
具体实施方式
21.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
22.在本发明的一些示例中，将dyx1c1外显子2区域删除一段序列后获得dyx1c1+/-杂合小鼠(f0)，随后f0代小鼠与fvb野生型小鼠交配获得大量的杂合小鼠(f1)，f1代之间再次交配即可以获得f2代小鼠，其中就包含有dyx1c1敲除小鼠(dyx1c1-/-)可用来后续的听力学检测实验。
23.为了揭示dyx1c1在听觉系统中所需的生物学功能，我使用crispr-cas9技术删除dyx1c1的第2外显子中的一个区域，从而使dyx1c1失活(图2a)。我们接下来研究了dyx1c1-/-小鼠是否与患有阅读障碍和原发性纤毛运动障碍小鼠中观察到的相似缺陷，与aarti tarkar的报告一致，dyx1c1-/-小鼠在p3时表现出内脏反位(图2b)，并且杂合子繁殖的dyx1c1-/-小鼠的百分比极低，只有少数敲除小鼠存活到p60，此外，dyx1c1+/-小鼠是存活的，与野生型小鼠(wild-type,wt)小鼠没有显著差异。随后，我们通过qpcr、pcr和western blot实验进一步证实dyx1c1在内耳中被敲除(图2c-e)，免疫荧光实验也发现dyx1c1在dyx1c1-/-小鼠耳蜗中的荧光信号明显降低(图2f)。这些数据表明dyx1c1-/-小鼠
已被成功改造为具有类似原发性纤毛运动障碍的病理特征，也可用于探索原发性纤毛运动障碍和听觉功能之间的相关性。根据既往报道，原发性纤毛运动障碍患者存在严重的感音神经性听力损失，但原发性纤毛运动障碍导致的耳蜗病理并没有明确的描述。为了阐明原发性纤毛运动障碍与感音神经性耳聋的关系，我们设计并构建了与原发性纤毛运动障碍患者病理特征相似的dyx1c1-/-小鼠。接下来，我们使用短声听性脑干反应(auditory brainstem response,abr)和短纯音abr技术评估了dyx1c1-/-小鼠的听觉功能，结果显示，与wt小鼠相比，p18、p30和p60 dyx1c1-/-小鼠在4～32khz之间的短声刺激和短纯音的abr阈值显著提高了约40～60db声压级(spl)(图2g-i)。随后，我们分析了频率为16khz的abr峰1潜伏期和振幅值，结果显示dyx1c1-/-小鼠的abr阈值仅为80db左右，其峰1潜伏期和振幅均是wt小鼠的2～3倍(图2j-l)，这表明dyx1c1-/-敲除小鼠sgn和ihcs之间的突触结构被破坏。综上所述，这些结果表明与dd和pcd相关的dyx1c1突变导致严重的耳聋。
24.纤毛束在耳蜗听觉信号转导过程中起着不可或缺的作用，对毛束的不可逆损伤可导致严重的听力损伤。我们之前发现dyx1c1-/-小鼠p18和p60表现出严重的听力损失。为探讨dyx1c1缺失是否会破坏耳蜗毛束结构，使用扫描电子显微镜(sem)进行观察。我们发现，与野生型小鼠相比，在p18,dyx1c1-/-小鼠耳蜗中大量畸变的动纤毛(kinocilia)没有完全退化，然而，纤毛束的形状和位置没有明显改变。此外，dyx1c1-/-小鼠耳蜗毛细胞和支持细胞上存在丰富的异常微绒毛(图3a,b)。根据之前的报道，小鼠在听力发生前动纤毛会逐渐退化，我们随后利用sem技术观察p4时期动纤毛的结构。结果显示，与wt小鼠相比，dyx1c1-/-小鼠耳蜗的动纤毛远端异常增大，呈球形(图3c)。随后，我们通过免疫荧光实验进一步观察动纤毛和纤毛束在毛细胞上的分布。p4小鼠耳蜗基底膜用抗myosin7a抗体标记毛细胞(蓝色)，用抗乙酰化微管蛋白抗体标记动纤毛(绿色)，用鬼笔环肽抗体标记纤毛束(红色)(图3d)。在dyx1c1-/-小鼠耳蜗中我们发现有大量的动纤毛偏离了纤毛束的顶点，但在纤毛束的取向和形态上，dyx1c1-/-小鼠与wt小鼠之间并没有明显的差异。这些数据也表明我们构建的dyx1c1-/-敲除小鼠可以很好的模拟纤毛类疾病。
25.通过上述示例的方法成功构建了dyx1c1敲除小鼠，并且该小鼠可以存活到第60天甚至更久，可以应用于很多需要长时程观察和检测dyx1c1敲除后各类疾病发生发展的研究中。dyx1c1敲除小鼠在出生后患有严重的听力损失，因此可以确定该敲除小鼠模型可以用于对阅读障碍和原发性纤毛运动障碍导致耳聋的病理特征及机制的研究。
26.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
27.以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

技术特征：
1.一种阅读障碍和耳聋疾病小鼠的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：dyx1c1外显子2区域删除一段序列，从而使dyx1c1失活，经繁殖培养后获得dyx1c1敲除小鼠。2.根据权利要求1所述的阅读障碍和耳聋疾病小鼠的构建方法，其特征在于，还包括以下步骤：观测构建的dyx1c1敲除小鼠是否与患有阅读障碍和原发性纤毛运动障碍小鼠中观察到的相似缺陷；使用短声听性脑干反应和短纯音abr技术评估dyx1c1敲除小鼠的听觉功能，观察小鼠耳蜗的毛束结构。3.根据权利要求1所述的阅读障碍和耳聋疾病小鼠的构建方法，其特征在于，获得dyx1c1敲除小鼠的具体步骤包括：dyx1c1外显子2区域删除一段序列后获得dyx1c1+/-杂合小鼠f0，随后杂合小鼠f0与fvb野生型小鼠交配获得杂合小鼠f1，杂合小鼠f1之间再次交配即可以获得杂合小鼠f2，其中就包含有dyx1c1敲除小鼠。4.根据权利要求1所述的阅读障碍和耳聋疾病小鼠的构建方法，其特征在于，观察小鼠耳蜗的毛束结构之前，分别用抗肌球蛋白、抗乙酰化微管蛋白、鬼笔环肽抗体对小鼠耳蜗基底膜的毛细胞、动纤毛和纤毛束进行免疫荧光染色。5.根据权利要求3所述的阅读障碍和耳聋疾病小鼠的构建方法，其特征在于，通过crispr-cas9技术删除dyx1c1外显子2区域部分序列。6.根据权利要求1所述的阅读障碍和耳聋疾病小鼠的构建方法，其特征在于，通过耳蜗细胞与抗体染色后观察或者筛查出dyx1c1敲除小鼠。7.根据权利要求1所述的阅读障碍和耳聋疾病小鼠的构建方法，其特征在于，所述的dyx1c1外显子2区域删除一段序列为tgatgggaagagcaaagccaagattggaaatgacacgattcttttcacatt gtataaaaaggagccagttctgtgggatagcctttct。8.权利要求1～7任一所述的小鼠模型构建方法在研究阅读障碍或原发性纤毛运动障碍中的应用。

技术总结
本发明公开了一种阅读障碍和耳聋疾病小鼠的构建方法及应用，属于生命科学耳鼻喉科学研究领域。该方法通过在Dyx1c1外显子2区域删除一段序列，从而使Dyx1c1失活，经繁殖培养后获得Dyx1c1敲除小鼠。与现有技术相比，本发明的方法只删除了Dyx1c1基因外显子2区域的部分序列，从而可以是幸存下来的Dyx1c1敲除小鼠存活更久。并且可以同时用于模拟研究阅读障碍和原发性纤毛运动障碍疾病特征，更适用于与耳聋相关的基础研究。相关的基础研究。相关的基础研究。


技术研发人员：柴人杰 洪国栋 程诚
受保护的技术使用者：东南大学
技术研发日：2023.02.21
技术公布日：2023/8/14